Eiwitten en nucleïnezuren

Wildtype E coli kern-RNAP werd tot expressie gebracht vanuit PVS10-plasmide dat codeert voor alle vijf subeenheden²⁸ en gezuiverd zoals beschreven²⁹. E coli RNAP zonder de Set off Loop kwam uit onze vorige studie²⁰. De 70S-ribosomen, EF-G, EF-Tu, EF-Ts, IF1-3, formylmethioninetransferase, methionyl-tRNA-synthetase en RelE werden gezuiverd zoals beschreven in ref. ⁷. Andere individuele aminoacyl-tRNA-synthetasen werden gekloond en gezuiverd zoals beschreven voor methionyl-tRNA-synthetase⁷. Aminoacylatie van tRNA’s en formylatie van Met-tRNA^fMet werden uitgevoerd zoals beschreven⁷, behalve het gebruik van individuele aminoacyl-tRNA-synthetasen in plaats van S100. Mengsels voor translatie-verlenging die individuele ternaire complexen bevatten, werden bereid met behulp van 80 pmol aminoacyl-tRNA’s, 200 pmol EF-Tu en EF-Ts, 150 pmol EF-G, 4 mM GTP in 17 μl koppelingsbuffer (CB; 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM NH₄Cl, 10 mM Mg(OAc)₂, 6 mM β-mercapto-ethanol). Mfd³⁰UvrD³¹RapA³²NusG en NusA⁷ werden allemaal gekloneerd in pET28a coderend voor N-terminale 6xHis-tag, gezuiverd zoals beschreven in referenties, waarbij His-tag vervolgens werd verwijderd door trombine (Sigma-Aldrich) splitsing volgens de instructies van de leverancier. SDS-gels van alle gezuiverde eiwitten worden getoond in Prolonged Knowledge Fig. 9a. Oligonucleotiden kwamen van IDT, behalve de pyrimidine-dimeer (T=T)-sjabloon van Gene Hyperlink. mRNA’s werden gesynthetiseerd met behulp van T7 RNAP en ³²P-radioactief gemerkt aan het 5′-uiteinde zoals beschreven in ref. ⁷. Oligonucleotiden en mRNA-sequenties worden getoond in Prolonged Knowledge Fig. 1.

EG-montage

Het in vitro gekoppelde systeem voor een experiment met 20 reacties werd als volgt samengesteld: 50 pmol matrijs-DNA en 30 pmol mRNA werden versmolten in 22 μl CB (25 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM NH₄Cl, 10 mM Mg(OAc)₂6 mM β-mercaptoethanol), gevolgd door toevoeging van 50 pmol RNAP en vervolgens 110 pmol niet-matrijs-DNA-oligo bij 37 ° C. EC’s werden geïmmobiliseerd op 5 µl streptavidine-Sepharose-korrels (Cytiva), geëquilibreerd in CB. Het systeem werd gewassen met CB + 1 M KCl en vervolgens met CB. De EC werd vervolgens gedurende 3 minuten per stap naar de gewenste locatie op de sjabloon gelopen met units van 10 µM NTP’s (getoond in Prolonged Knowledge Fig. 1 voor alle EC’s) en wassen met CB tussen de stappen. Bij de meeste experimenten werd de laesie in één stap bereikt door gelijktijdige toevoeging van CTP (cytidinetrifosfaat), UTP (uridinetrifosfaat) en GTP. Voor de vorming van stabiel teruggetrokken EC werden 1 mM NTP’s toegevoegd aan de EC gevormd op de matrijs zonder DNA-laesie (Prolonged Knowledge Fig. 1a) gedurende 5 minuten. Dit resulteert erin dat de EC de streptavidine-kraal bereikt, wat leidt tot stabiele backtracking, zoals beschreven in ref. ⁷. Vervolgens werd 4 mM GTP gebruikt voor verkeerde opname in plaats van AMP aan het 3′-uiteinde van mRNA gepauzeerd op de matrijs zonder laesie (Prolonged Knowledge Fig. 1a). Voor alle reacties werden de EC’s grondig gewassen met CB en het reactievolume werd aangepast op 10 μl. Voor beoordeling van de translocatietoestand van vastgelopen EC’s werd 5 pmol GreA of GreB of 500 µM pyrofosfaat (PPi) toegevoegd bij 37 ° C gedurende de tijden aangegeven in Prolonged Knowledge Fig. 1b. Voor de zoutstabiliteitstest werd de reactie overgebracht naar CB + 1 M KCl en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gelaten vóór scheiding van de supernatant- en parelfracties en analyse zoals hieronder beschreven.

Gekoppelde transcriptie-vertaling

De vertaling werd geïnitieerd op het mRNA van de EC’s door toevoeging van 20 μl CB dat 200 pmol ribosomen bevatte, 200 pmol fMet-tRNA^fMet200 pmol van elk van IF1-3 en 4 mM GTP bij 37 ° C gedurende 8 minuten. Het gekoppelde systeem werd gewassen met CB, het quantity aangepast tot 25 μl en gescheiden in 5 μl reacties. Waar aangegeven werden de reacties gedurende 2 minuten bij 37 ° C voorzien van 5 pmol van een issue (NusA en NusG, RapA of UvrD) in 3 μl CB. RapA- en UvrD-reacties bevatten ook 2 mM dATP (eindconcentratie). De translatie-verlenging werd gestart met 17 μl overeenkomstig verlengingsmengsel van ternaire complexen met EF-G / GTP (hierboven). Waar aangegeven werd gelijktijdig met het translatie-verlengingsmengsel 100 µM NTP’s of 400 µM streptolydigine (eindconcentraties) toegevoegd. Males liet de reacties 4 minuten bij 37°C verlopen. Parels werden gescheiden van het supernatant. Daarna werden de kralen gewassen met 1 ml CB en werden de volumes van de kralen en de supernatantfracties aangepast tot 21 μl elk. Vervolgens werden monsters van 5 µl genomen voor blootstelling aan 20 pmol RelE gedurende 5 minuten bij 37 °C of 5 pmol GreB gedurende 30 seconden bij 37 °C. De reacties werden gemengd met een gelijk quantity formamide en EDTA-bevattende buffer. Producten werden opgelost in 10% denaturerende (8 M ureum) polyacrylamidegel, onthuld met behulp van fosforimaging (Cytiva) en geanalyseerd met behulp van ImageQuant-software (Cytiva). De methode voor het kwantificeren van EC-verdrijving wordt uitgelegd in Prolonged Knowledge Fig. 9b. Kwantificering in cijfers toont gemiddelden ± sds van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Related P waarden worden boven of naast de histogrammen weergegeven. Er werden plots gegenereerd met behulp van ggplot2 en de getoonde statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van stat_compare_means (Pupil’s T-test) in RStudio (v.2022.07.2).

Uitdagend gekoppeld systeem met Mfd

Voor het experiment met Mfd werd een EC met langere stroomopwaartse DNA-duplex gebruikt (Prolonged Knowledge Fig. 1a). Het ribosoom mocht alleen verlengen door F- en V-codons, waardoor het ribosoom werd gestopt op de minimale afstand van de EC die vastzat bij de T = T-laesie (25 nts tussen de actieve centra van ribosoom en RNAP; Uitgebreide gegevens Fig. 1a). Het gekoppelde systeem werd gewassen en het quantity werd aangepast zoals hierboven, en 5 pmol Mfd en 2 mM ATP werden gedurende 3 minuten bij 37°C toegevoegd. Parels en bovenstaande fracties werden gescheiden en geanalyseerd zoals hierboven.

Uitdagende vastgelopen EC’s met achterblijvende EC

Vastgelopen EC’s werden verkregen zoals hierboven op het nucleïnezuurscaffold getoond in Prolonged Knowledge Fig. 1e. Na wassen werd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur 25 pmol tweede (achterliggende) 5′-radioactief gelabeld RNA-transcript toegevoegd, gevolgd door toevoeging van 50 pmol RNAP. Complexen werden gewassen met CB en gedurende 5 minuten voorzien van 20 µM NTP’s. De supernatant- en kralenfracties werden gescheiden en geanalyseerd zoals hierboven.

EG-voorbereiding voor cryo-EM

Voor cryo-EM zijn nucleïnezuren weergegeven in Prolonged Knowledge Fig. 1a werden gebruikt, behalve de niet-matrijsstreng, die een UV-fotosplitsbare groep aan het biotine-uiteinde (IDT) bevatte, waardoor elutie van kralen mogelijk was. De EC’s werden in twee batches bereid, beginnend met het samenvoegen van 50 pmol mRNA en 50 pmol matrijs-DNA in 15 µl CB, gevolgd door de toevoeging van 60 pmol RNAP gedurende 5 minuten en 150 pmol niet-matrijs-DNA gedurende vijf minuten. verdere minuten. De EC’s werden geïmmobiliseerd op 12 µl slurry van streptavidinekralen en gewassen met CB + 1 M KCl en vervolgens CB. De EC’s werden naar de T=T-laesie gelopen met behulp van 20 µM GTP, CTP en UTP (eindconcentratie), gevolgd door CB-wassingen. Gedurende 3 uur werd 20 µM ATP toegevoegd. De volumes van de reacties werden met CB aangepast tot 50 µl. Vastgelopen EC’s werden uit de kralen geëlueerd door blootstelling aan 365 nm licht van de lamp BDH VL-206BL (Vilber-Lourmat) uitgerust met T-6L lichtbuizen gedurende vier rondes van 30 s. Supernatanten werden samengevoegd en geconcentreerd tot 25 µl op Amicon-50 0,5 ml filter (Merck Millipore).

Cryo-EM-rastervoorbereiding

UltrAuFoil300 R1.2/1.3 gouden roosters met gaten (Quantifoil) werden positief gloeiend geladen met behulp van een EasyGlow Discharge System (PELCO) bij 25 mA gedurende 4 minuten bij 0,26 mBar. Dit werd gevolgd door drie toepassingen van 3,5 µl geëlueerde EC’s met behulp van een Vitrobot Mark IV (FEI) met 100% kamervochtigheid bij 4 ° C, voordat het in vloeibaar ethaan werd ingevroren.

Cryo-EM-gegevensverzameling en -verwerking

De workflow en statistieken van cryo-EM-analyse worden getoond in Prolonged Knowledge Fig. 7a en uitgebreide gegevenstabel 1respectievelijk. Rasters werden afgebeeld met behulp van een Glacios cryo-TEM (Thermo Scientific), met een Falcon 4-elektronendetector (Thermo Scientific), in het York Biostructure Laboratory (York College). Er zijn in totaal 16.264 video’s opgenomen in EPU (Thermo Scientific) met een nominale vergroting van ×240.000 en een pixelgrootte van 0,574 Å/pix met een defocusbereik van −0,8 tot −2,0 µM. Gegevens werden verzameld met een blootstelling van 6,4 s, 1.574 subframes (totaal frames) en een dosis per body van 0,03246 elektronen per Ų om een ​​totale dosis van 50 elektronen per Å te geven².

Video’s zijn bewegingsgecorrigeerd met behulp van motioncorr2 (ref. ³³) vóór schatting van de contrastoverdrachtsfunctie (CTF) met CTFFIND4 (ref. ³⁴), in RELIE³⁵. Deze video’s waren ook bewegingsgecorrigeerd en de CTF werd geschat met behulp van cryoSPARC-implementaties³⁶ om het gebruik van iteratieve cryoSPARC tweedimensionale (2D) deeltjessorteringsalgoritmen mogelijk te maken, beginnend met een initiële blob-pick met behulp van een boxbereik van 100-300 pixels en 15 Å laagdoorlaatgefilterde microfotobeelden, waarbij 2.431.144 deeltjes worden gevonden. De laatste 160.183 deeltjes werden overgebracht vanuit cryoSPARC en geëxtraheerd in RELION met een doosgrootte van 500 pixels, 5 x 5 weggegooid naar 100 pixels met een pixelgrootte van 2,87 Å/pix en onderworpen aan verschillende rondes van verdere 2D-classificatie en deeltjesselectie. De 143.018 deeltjes uit de uiteindelijke selectie van de 2D-classificatie werden vervolgens gebruikt om een ​​eerste mannequin te genereren through een RELION-gradiëntgestuurd algoritme met een maskerdiameter van 250 Å. Dit initiële mannequin werd geconverteerd en opgeschaald met behulp van de RELION opdrachtregelafbeeldingshandler naar een doosgrootte van 500 pixels met een pixelgrootte van 0,574 Å/pix, terwijl de deeltjes opnieuw werden geëxtraheerd met dezelfde doos- en pixelgroottes. De deeltjes werden vervolgens onderworpen aan driedimensionale (3D) classificatie, waardoor de verdere verwijdering van ongewenste deeltjes mogelijk werd, waardoor 131.098 deeltjes overbleven voor automatische 3D-verfijning. De verfijnde kaart werd vervolgens nabewerkt tot 3,1 Å vóór geavanceerde deeltjesverwerking met behulp van CTF-verfijning en Bayesiaanse polijstopdrachten. De daaropvolgende laatste 3D-verfijning en nabewerking werd uitgevoerd met een zacht masker van de gehele EC, resulterend in een uiteindelijke kaartresolutie van 2,87 Å, zoals gerapporteerd door RELION.

Modelbouw en verfijning

Een initieel mannequin werd strak aangepast aan de uiteindelijke kaart in ChimeraX (UCSF) met behulp van het door cryo-EM knowledge gegenereerde mannequin van de E coli RNAP EC³⁷ (Eiwitgegevensbank (PDB) ID 8FVR). Dit mannequin werd vervolgens onderworpen aan echte ruimteverfijning in phenix³⁸ en handmatig bewerken in COOT³⁹. De T=T-laesie werd gebouwd in plaats van template-DNA-residuen als een ligand met behulp van een T=T-laesie van een T7-RNAP dat was vastgelopen op de T=T-laesie⁴⁰ (VOB-ID 1SL2). Further DNA- en RNA-uitbreidingen van de hoofdketens werden voltooid in Coot, vóór verdere cycli van verfijning en verwerking in phenix en Coot. Resolutie van de puntspreidingsfunctie (uitgebreide gegevens afb. 7c) werd berekend met behulp van cryoEF⁴¹.

Rapportageoverzicht

Meer informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting natuurportfoliorapportage gekoppeld aan dit artikel.