Het werd onder onze aandacht gebracht door Elisabeth M. Bik dat, in Ohya et al. Natuur In 2009 zijn de blots aangegeven door Syntaxin 13 in Fig. 2a duplicaten in lanen 1 en 3 en in lanen 4 en 5. Bovendien zijn de twee blots aangegeven door EEA1 en rabenosyn-5 in lane 4 van Fig. 2a duplicaten van de twee blots aangegeven door EEA1 en rabenosyn-5 in figuur 2b, baan 1. We hebben een grondig intern onderzoek uitgevoerd door alle originele gegevens die beschikbaar zijn in ons archief opnieuw te analyseren. Van de acht gevlekte panelen hebben we één technische fout gevonden die de conclusies van het artikel niet verandert. Hieronder vindt u de samenvatting van ons onderzoek en de originele autoradiografieën die zijn gebruikt om de cijfers op te stellen.

Om figuur 2a en figuur 2b te begrijpen, is het belangrijk om het volgende op te merken:

1. 1.

   De panels werden samengesteld met behulp van gegevens uit verschillende experimenten met veel reacties bestaande uit verschillende combinaties van proteoliposomen die integrale membraaneiwitten bevatten, bijvoorbeeld Syntaxin 13, VTI1A en Syntaxin 6. De proteoliposomen werden verdeeld over verschillende buisjes en oplosbare recombinante eiwitten, zoals Rab5, EEA1 rabenosyn-5, enz., werden in verschillende combinaties (zoals aangegeven) aan elke reactie toegevoegd.

2. 2.

   Figuren 2a en b tonen een samenstelling van verschillende experimenten, waarbij de panelen afbeeldingen tonen van de eiwitten in de reconstitutie-experimenten als representatieve voorbeelden. Dit komt omdat de complexiteit van de biochemische experimenten verschillende reacties vereist, intern gecontroleerd en reproduceerbaar. Verschillende van dergelijke experimenten werden uitgevoerd over een periode van twee jaar (2006-2008). Er was geen selectie van experimenten, alle experimentele gegevens werden geanalyseerd en opgenomen in de statistieken. Een voorbeeld van de reproduceerbaarheid van de gegevens wordt hieronder weergegeven (zie aanvullende informatie), waarbij twee autoradiografieën van experimenten uitgevoerd op 01-05-07 en 01-11-07 naast elkaar worden vergeleken.

3. 3.

   De hoeveelheid oplosbare eiwitten die in de proteoliposomen werden gerecruteerd, werd geschat door kwantitatieve Western blots (WB), zoals beschreven. Vanwege materiaalbeperkingen kon de WB van Syntaxin13 alleen op de moedermengsels worden uitgevoerd. Twee originele Syntaxin 13 WB van de moedermengsels gebruikt in figuur 2a worden hieronder getoond.

1. A)

   De blots van Syntaxin 13 zijn identiek in lanen 1 en 3 omdat precies dezelfde proteoliposomen werden gebruikt en geïncubeerd met oplosbare eiwitten zoals aangegeven. De WB-band van figuur 2a, banen 1 en 3 komt overeen met baan 5 van het originele autoradiogram van 08-09-08 (zie Aanvullende figuren).

2. B)

   Figuur 2a baan 2 komt overeen met baan 4 van hetzelfde autoradiogram.

3. C)

   Figuur 2a baan 4 is verkeerd gemonteerd omdat deze overeenkomt met baan 1 van het originele autoradiogram 09/08/08.

4. D)

   Figuur 2a baan 5 komt overeen met baan 3 van het originele autoradiogram 31/08/08 (Aanvullende figuren).

5. e)

   Figuur 2a baan 6 komt overeen met baan 4 van het originele autoradiogram 31/08/08

1. 4.

   Figuur 2b vergelijkt de rekrutering van oplosbare recombinante eiwitten door proteoliposomen die verschillende combinaties van transmembraaneiwitten bevatten (Syntaxin 13 versus Syntaxin 7). Figuur 2b, lanen 1 en 2 bevatten dezelfde proteoliposomen en oplosbare recombinante eiwitten als in figuur 2a, baan 4 (volledige reactie met proteoliposomen en oplosbare eiwitten), behalve dat de reactie wordt geïncubeerd in afwezigheid (Fig. 2b, baan 1) of aanwezigheid (Fig. 2b, baan 2) van cytosol. Dit betekent dat de associatie van oplosbare eiwitten (EEA1, rabenosyn-5 evenals Rab5) met het membraan opnieuw moet worden beoordeeld, ook voor de bijdrage van cytosol (Fig. 2b, baan 2). Het experiment toont aan dat het de combine van endosomale transmembraaneiwitten is die de membraanrekrutering van de oplosbare eiwitten reguleert, zonder dat cytosol een significante bijdrage levert. We hebben een kleine fout ontdekt in de tekening van de foutbalk in figuur 2a, EEA1 baan 4, die identiek is aan figuur 2b, baan 1, en hebben deze gecorrigeerd.

Het belangrijkste is dat alle eiwitten in de figuren, inclusief Syntaxin13, werden genormaliseerd door de hoeveelheid fosfolipiden om de verhouding eiwit/fosfolipiden te behouden. Dit is belangrijk omdat zelfs als de eiwitniveaus vergelijkbaar zijn, de verhouding eiwit/fosfolipiden gecontroleerd moet worden.

We danken Elisabeth M. Bik voor het onder onze aandacht brengen van deze kwestie en het bieden van de mogelijkheid om de cijfers voor de te verduidelijken Natuur lezers. Onze excuses dat we niet hebben uitgelegd dat de WB-band van figuur 2a, rijstroken 1 en 3 hetzelfde waren; voor het onbedoeld dupliceren van de band van Syntaxin 13 in figuur 2a, lanen 4 en 5; en omdat we niet hebben uitgelegd dat de Syntaxin 13 WB-band van figuur 2b, baan 1 hetzelfde was als in figuur 2a, baan 4. We hebben een gecorrigeerde figuur 2a voorbereid (zie figuur 2a). 1 hieronder) waarin de Syntaxin 13-band van baan 4 is vervangen door de juiste, en de legenda dienovereenkomstig is bewerkt.

Rekrutering van Rab5, EEA1 en rabenosyn-5 op proteoliposomen. AProteoliposomen met een vergelijkbaar fosfolipide- en syntaxine 13 (STX13)-gehalte als vroege endosomen (als controle, baan 6) werden geïncubeerd met de aangegeven eiwitten (zie Methoden). Membraan-geassocieerde eiwitten werden gedetecteerd door Western-blotting, gekwantificeerd en genormaliseerd naar 1 (willekeurige eenheden, au) met de waarden in baan 4. De getoonde banden zijn representatief voor ten minste drie herhaalde experimenten. Er was geen selectie van experimenten; alle experimentele gegevens werden geanalyseerd en opgenomen in de statistieken. De WB van Syntaxin13 werd uitgevoerd op de moedermengsels van de proteoliposomen, verdeeld over verschillende reacties en gepresenteerd ter vergelijking met endogene niveaus van Syntaxin13 in vroege endosomen (laan 6). Merk op dat de band van Syntaxin 13 identiek is in de banen 1 en 3, omdat precies dezelfde proteoliposomen werden gebruikt. BCognate t-SNARE’s zijn noodzakelijk voor de stabiele membraanrekrutering van EEA1 en rabenosyn-5. Proteoliposomen met verschillende SNARE-sets werden geïncubeerd met recombinante eiwitten, met of zonder verdere incubatie met cytosol. Merk op dat de EEA1- en rabenosyn-5 WB-banden van baan 1 in figuur 2b dezelfde zijn als die van baan 4 in figuur 2a, en getoond ter vergelijking met de reactie in aanwezigheid van cytosol (figuur 2b, baan 2) . Membraanassociatie werd gemeten zoals in A. C, DCognate t-SNARE’s zijn noodzakelijk voor cytosol-afhankelijke proteoliposoomfusie. Membraanfusie van verwante (lanen 1 en 2) of niet-verwante (lanen 3 en 4) t-SNARE-proteoliposomen met endosomen (C) of v-SNARE-proteoliposomen (D) met of zonder cytosol werd gemeten zoals in Fig. 1. Histogrammen tonen het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten en sem

Onze excuses voor de verwarring die het gebrek aan gedetailleerde informatie over de cijfers mogelijk heeft veroorzaakt.