Home Natuur Structuren van het promotorgebonden respiratoir syncytieel viruspolymerase

Structuren van het promotorgebonden respiratoir syncytieel viruspolymerase

0
Structuren van het promotorgebonden respiratoir syncytieel viruspolymerase


Expressie en zuivering van het RSV-polymerase (L-P-complex)

De expressie en zuivering van het RSV-polymerase (L-P-complex) werd als volgt uitgevoerd. De voor codons geoptimaliseerde helperplasmiden van de L- en P-eiwitten van RSV (stam A2) werden verkregen van BEI Sources. De L- en P-genen werden gesubkloneerd in de pFastBac Twin-vector (Invitrogen) met het RSV L-gen in open leesframe 1 en het RSV P-gen in open leesframe 2. Een 6xHis-tag werd toegevoegd aan het N-uiteinde van de RSV. L-eiwit, gescheiden door een TEV-protease-splitsingsplaats. Vervolgens werd de recombinante pFastBac Twin-vector getransformeerd in Escherichia coli DH10Bac voor het genereren van bacmid-DNA. Het Cellfectin II-reagens (Thermo Fisher Scientific) werd gebruikt om het bacmid-DNA in Sf21-cellen (Thermo Fisher Scientific) te transfecteren om de recombinante baculovirussen te verkrijgen. Sf21-cellen werden geïnfecteerd door de recombinante baculovirussen in suspensiekweek en 72 uur na infectie verzameld door 15 minuten centrifugeren bij 1000°C.G. De verzamelde cellen werden opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer (50 mM natriumfosfaat pH 7,4, 300 mM NaCl, 6 mM MgSO4).410% glycerol, 0,2% NP-40, EDTA-vrije proteaseremmer), gelyseerd met een homogenisator en geklaard door 60 minuten centrifugeren bij 16.000G. Het geklaarde lysaat werd geïncubeerd met Co2+-NTA-agarosehars (GoldBio) en gewassen met wasbuffer (50 mM natriumfosfaat pH 7,4, 300 mM NaCl, 6 mM MgSO4410% glycerol, 10 mM imidazol) en de RSV L-P-complexen werden geëlueerd met elutiebuffer (50 mM natriumfosfaat pH 7,4, 300 mM NaCl, 6 mM MgSO4410% glycerol, 250 mM imidazool). Het geëlueerde monster werd behandeld met TEV-enzym en op Co2+-NTA-agarosehars. Het doorstroommonster werd op een heparinekolom aangebracht en verder gezuiverd door middel van grootte-uitsluitingschromatografie met gelfiltratiebuffer (25 mM HEPES pH 7,4, 300 mM NaCl, 6 mM MgSO4).40,5 mM tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP)) met behulp van een Superose 6 Verhoog 10/300 GL-kolom (GE Healthcare). SDS-PAGE werd gebruikt om de kwaliteit van gezuiverde eiwitten te analyseren. De zuivere eiwitten werden opgeslagen in porties van 30 μl bij -80 ° C nadat ze snel waren ingevroren in vloeibare stikstof voor verder gebruik. Deze procedures zijn eerder beschreven10.

In vitro RNA-synthesetest

Bij de RNA-synthesetest werden RNA-promotersequenties met verschillende lengtes van het Le-gebied van het genoom en het TrC-gebied van het antigenoom gebruikt. De oligonucleotiden, zoals Le10 en TrC10, werden chemisch gesynthetiseerd door Built-in DNA Applied sciences (Coralville, IA, VS) of Horizon Discovery (Waterbeach, VK) en hadden hydroxylgroepen (OH) aan zowel de 3′- als de 5′-terminals.

Radioactieve isotoop-gelabelde nucleotiden, (α-32P)GTP en (γ-32P)ATP, werden gekocht bij Perkin Elmer. De reactiemengsels bestonden uit 2 μM RNA-sjabloon (zonder RNA-sjabloon als controle), de RSV L-P-complexen (ongeveer 300 ng RSV L), NTP’s (ATP bij 50 μM met 5 μCi van (γ-32P)ATP of CTP bij 1,25 mM en ATP bij 50 μM met 5 μCi (γ-32P)ATP werd gebruikt in Prolonged Information Fig. 10a, c; GTP bij 50 μM met 5 μCi van (α-32P)GTP of CTP bij 1,25 mM en GTP bij 50 μM met 5 μCi van (α-32P)GTP werd gebruikt in Prolonged Information Fig. 10b; GTP bij 50 μM met 5 μCi van (α-32P)GTP of ATP bij 1,25 mM en GTP bij 50 μM met 5 μCi van (α-32P)GTP werd gebruikt in Prolonged Information Fig. 10d) en reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 8 mM MgCl25 mM dithiothreïtol, 10% glycerol) in een eindvolume van 20 μl. De reactiemengsels werden 2 uur bij 30 °C geïncubeerd en 5 minuten verwarmd tot 90 °C. Vervolgens werd 5 μl van de stopbuffer (90% formamide, 20 mM EDTA, 0,02% broomfenolblauw) aan elk reactiemengsel toegevoegd (Prolonged Information Fig. 10). De met isotoop gemerkte nucleotiden met dezelfde concentratie werden vers gekocht en voor de reacties gebruikt. Alleen de reactiemengsels die dezelfde radioactieve isotoop-gelabelde NTP’s bevatten, werden direct vergeleken op duidelijkheid. De RNA-producten werden geanalyseerd door elektroforese op een 20% polyacrylamidegel die 7 M ureum bevatte in een Tris-boraat-EDTA-buffer, gevolgd door fosforbeeldvorming met een Hurricane FLA 7000-scanner (GE Healthcare). De molecuulgewichtsladders werden gegenereerd door Tr5, Tr7, Tr14, Tr21 en Tr25 te labelen met (γ-32P)ATP met behulp van T4-polynucleotidekinase (M0201L, NEB) volgens de protocollen van de fabrikant (NEB).

Cryo-EM-rastermonstervoorbereiding en data-acquisitie

We hebben 0,35 mg ml geïncubeerd−1 gezuiverd RSV-polymerase met 30 µM Le10, 150 µM GTP en CpNpp of 30 µM TrC10, 150 µM GTP en ApNpp bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Vervolgens hebben we 3,0 μl van de geassembleerde complexen aangebracht op door gloeien ontladen UltrAuFoil 300 mesh R1.2 / 1.3-roosters (Electron Microscopy Sciences) voor respectievelijk Le10 en TrC10. Hierna hebben we de roosters gedurende 3 seconden bij een luchtvochtigheid van ongeveer 100% geblot en ze snel ingevroren in vloeibaar ethaan met behulp van een FEI Vitrobot Mark ΙV.

Beelden werden verzameld met Leginon 3.5 op FEI Titan Krios-microscopen die werkten bij een versnellingsspanning van 300 kV met een Gatan K3-camera met een pixelgrootte van 1,058 Å. Het defocusbereik werd ingesteld van −0,8 μm tot −2,5 μm. Er werden dosis-gefractioneerde beelden opgenomen met een belichtingstijd per body van 2000 ms en een dosis van ongeveer 1.305 elektronen per vierkante ångström per body. De totale geaccumuleerde dosis bedroeg ongeveer 52,21 elektronen per vierkante ångström. Er werden in totaal 6.741 microfoto’s verzameld voor het Le10-gebonden RSV-polymerase, en 7.777 microfoto’s werden verzameld voor het TrC10-gebonden RSV-polymerase.

Cryo-EM-gegevensverwerking

Bewegingscorrectie van de gegevens voor RSV-polymerase in complicated met Le10 werd uitgevoerd met het programma MotionCor2 (ref.37). De contrastoverdrachtsfunctie werd geschat met behulp van het programma CTFFIND4 (ref.38). In totaal werden 3.658.410 deeltjes automatisch geselecteerd door crYOLO27, en een doosgrootte van 200 pixels werd gebruikt om de deeltjes te extraheren. Deeltjes 2D-classificatie, initiële 3D-modelbouw, 3D-classificatie, 3D-verfijning, verfijning van de contrastoverdrachtsfunctie en polijsten werden uitgevoerd met behulp van RELION 3.1.3 (ref.26). De uiteindelijke verfijning werd gevalideerd met behulp van cisTEM39, waarbij de beste klasse als initiële mannequin wordt gebruikt. De globale zoekopdracht werd één keer zonder masker uitgevoerd, gevolgd door nog een globale zoekopdracht met behulp van een zacht masker (zachte rand van 6 pixels) gegenereerd in RELION. Na 2D- en 3D-classificaties werden 358.385 deeltjes geselecteerd voor de uiteindelijke 3D-verfijning en polijsting, resulterend in een cryo-EM-kaart met een resolutie van 3,40 Å. De TrC10-gebonden RSV-polymerasegegevensset werd met behulp van een vergelijkbare methode verwerkt. In totaal werden 3.646.076 deeltjes uitgekozen voor verdere gegevensverwerking. Uiteindelijk werden 197.859 deeltjes geselecteerd na 2D- en 3D-classificatie en onderworpen aan een laatste 3D-verfijning en polijsten, wat een cryo-EM-kaart opleverde met een resolutie van 3,41 Å.

Alle gerapporteerde resoluties waren gebaseerd op verfijningsprocedures volgens de gouden standaard en het Fouriershell-correlatie = 0,143-criterium. De lokale resolutie werd geschat met behulp van ResMap40. Verdere gegevensverwerking en verfijningsdetails zijn samengevat in Uitgebreide Gegevens Fig. 1 En 2 en aanvullende tabel 1.

Modelbouw en figuurvoorbereiding

Het initiële mannequin dat in de cryo-EM-kaart voor het RSV-polymerasecomplex met Le10 of TrC10 was gekoppeld, waren de apo RSV-polymerase-coördinaten (VOB: 6UEN). UCSF Chimera en COOT werden gebruikt voor het aanpassen van het oorspronkelijke mannequin28,29. De uiteindelijke structuren van het RSV-polymerase in complicated met Le10 of TrC10 werden gebouwd en verfijnd met behulp van COOT en PHENIX, en de modelgeometrieën werden gevalideerd met behulp van MolProbity29,30,31. Aanvullende tabel 1 vat de gegevensverzameling en modelverfijningsstatistieken samen. De software program die in dit undertaking wordt gebruikt, is samengesteld door SBGrid41. Alle figuren die model- en elektronendichtheidskaarten vertegenwoordigen, zijn gegenereerd met behulp van COOT29UCSF-hersenschim25 en PyMOL32. Uitlijning van meerdere sequenties werd uitgevoerd met behulp van Multalin42 en ESPript43.

Rapportageoverzicht

Meer informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Samenvatting van de natuurportfoliorapportage gekoppeld aan dit artikel.

LEAVE A REPLY

Please enter your comment!
Please enter your name here